T7 RNAP提取

注意：从菌体破碎到分装冻存需要24小时内完成，避免影响酶活性。活性检测可在分装冻存后随机抽检，合格后用于制备型转录实验。

  1. 小摇：接菌至50mlLB培养基，37度培养过夜（12-16h）(amp抗性，母液1：1000添加进培养基中)
  2. 配制大瓶培养基：1L/瓶，建议配6-8瓶（121度20min灭菌，待温度降至80度及时将培养基取出灭菌锅）
  3. 大摇：
    • 先按照1：1000加入amp抗生素，再将小摇得到的过夜培养菌液接种进培养基（5-10ml/瓶）
    • 将接种完的大瓶37度震荡（220rpm）培养至OD600为0.5-0.8（理论上，37度培养3h，再将培养箱温度调成20度降温1h可达标准）
    • 在冷却过的培养基中分别加入500微升1M IPTG母液（此步骤可用未开封的1ml注射器穿透封口的锡箔纸加入以避免开关摇瓶）
    • 将诱导过的摇瓶在20度震荡过夜
  4. 收菌：将培养过的菌液于4000rmp离心20min，离心上清倒回摇瓶并加入NaOH除去未收集到的菌，用lysis buffer清洗一次收集到的菌
  5. 高压破碎: 将收集到的菌充悬于lysis buffer（建议终体积不要超过240mL，但太少也会导致破菌不充分），加入PMSF高压破菌（需提前将破碎仪降温并清洗、buffer润洗）
  6. 高速离心：18000rpm离心20min（此步骤需要用电子天平精确配平，配平双方相差小于0.1g）
  7. 挂柱：
    • 清洗柱子：若是旧柱子建议先用EDTA脱镍并用ddH2O清洗后再加入NiSO4重新挂镍（新beads不用），然后用ddH2O清洗，用lysis buffer清洗备用
    • 挂柱：将润洗过的镍柱内buffer流尽，堵紧出液口，加入高速离心所得上清，堵住柱子上口，于4度旋转挂柱2h，建议使用蠕动泵上样和洗杂蛋白
  8. 洗杂： 将结合完的柱子内溶液流出并收集以备不测（流穿液），用含有40mM咪唑的buffer不断清洗beads至无蛋白被洗下为止（此步骤需要用大量的buffer，建议使用蠕动泵，蠕动泵用前需要清洗: 20%乙醇，H2O，buffer）
  9. 洗脱：洗杂完成后用含有250mM咪唑的buffer进行洗脱，建议少量多次以减少所得洗脱液的体积
  10. 纯度检测：SDS-PAGE，确保纯度大于90%后进入下一步
  11. 产量检测：使用洗脱缓冲液做blank，通过测定A280来计算T7的浓度和产量。典型值是10L培养基，800mg
  12. 浓缩换液：用30kD的超滤管将洗脱液进行浓缩并换液至DEPC水配制的T7 storage buffer；离心时需要防止上液体积过小使得蛋白浓度过高造成沉淀，通常需要保持浓度低于20mg/mL（如果还是有沉淀产生，可以继续降低浓度，但是此条件下通常不会有沉淀）；可以根据产量计算最小浓缩体积，然后选择浓缩管数量，每根浓缩管可以浓缩到1.5mL。长时间离心时，蛋白质溶液会分层，可以中途停止离心并将上液吹吸混匀，以防止蛋白底部浓度过高导致沉淀（待考察，可能不会沉淀）。
  13. 分装存储：将换液完成的T7稀释至10-15mg/mL，并加入20%甘油，分装至500微升/1.5mLEP管，用液氮冷冻，保存于-80度
  14. 洗脱后的所有操作都要防止RNA酶污染T7
  15. 活性检测、RNA酶污染检测

Buffer A: 20mM Tris-HCl，500mM NaCl

Buffer B: 20mM Tris-HCl，500mM NaCl ，1M 咪唑

lysis buffer： 20mM Tris-HCl，500mM NaCl， 20mM咪唑，5%甘油

T7 storage buffer：见瓶身（配方来源于NEB的商业化T7 RNA聚合酶），DEPC水配制，全程防止RNA酶污染 https://www.neb.cn/zh-cn/products/m0251-t7-rna-polymerase#%E4%BA%A7%E5%93%81%E4%BF%A1%E6%81%AF_%E7%89%B9%E6%80%A7%E5%92%8C%E7%94%A8%E6%B3%95